reparacion de adn

Proteína de reparación alberga al ADN dañado
Investigadores del Instituto Médico Howard Hughes han generado las primeras imágenes detalladas de una proteína que realiza la crucial tarea de detectar y reparar hebras rotas de ADN. Las imágenes muestran que la proteína está diseñada para albergar al ADN mientras éste es reparado y vuelto a unir con gran precisión.
Las imágenes de la proteína Ku de reparación de ADN fueron publicadas en el número del 9 de agosto de 2001, de la revista Nature , por el investigador del Instituto Médico Howard Hughes Jonathan Goldberg y sus colegas John R. Walker y Richard A. Corpina del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Las roturas en la doble hebra de ADN pueden ocurrir aleatoriamente como resultado de la exposición a radiaciones ionizantes o como eventos programados durante el intercambio de genes necesario para crear los linfocitos que combaten a las infecciones. El heterodímero Ku, que consiste en dos subunidades, Ku70 y Ku80, es miembro de una familia de proteínas de reparación de ADN que reparan al ADN cortado para preservar la integridad del genoma. Cuando Ku encuentra un ADN dañado, inicia un proceso de reparación, llamado unión del extremo no-homólogo (NHEJ, por sus siglas en inglés), proceso que vuelve a unir los extremos cortados de la doble hebra, aunque los extremos de cada hebra de ADN no sean complementarios.
La función de Ku en el mantenimiento de la integridad del genoma fue establecida por estudios anteriores en los cuales el investigador del HHMI, Frederick W. Alt y sus colegas anularon a Ku70 y a otros componentes de NHEJ y encontraron que la reparación del ADN estaba comprometida, y que ocurrían cambios cromosómicos aberrantes con alta frecuencia. Aunque estos estudios reforzaron la función de Ku en la reparación del ADN, los detalles sobre cómo Ku realiza la detección e inicia la reparación seguían siendo incompletos. “La bioquímica es muy clara”, dijo Goldberg. “Ku se encuentra en el núcleo lista para detectar daños en el ADN y para unir los extremos del mismo”.
Lo que seguía siendo confuso, sin embargo, era cómo Ku podía distinguir con tal precisión entre los extremos cortados y el ADN intacto. “Además, el unir nuevamente el ADN parece peligroso debido a la probabilidad de perder información genética”, dijo Goldberg. “Pero, en realidad, el proceso que ensambla los extremos no-homólogos es muy preciso, y queríamos saber por qué Ku parece ser tan necesaria para tal precisión.”
Goldberg y sus colegas creían que el poder ver cómo se une Ku al ADN proporcionaría respuestas a algunos de los interrogantes sobre la interacción entre Ku y el ADN. Los investigadores utilizaron una técnica llamada cristalografía de rayos X para visualizar la interacción entre el heterodímero Ku y el ADN. Para realizar la cristalografía de rayos X, se bombardean los cristales de una proteína con intensos haces de rayos X. A medida que los rayos X rebotan con los átomos del cristal, emiten un patrón de difracción que, entonces, se puede analizar para determinar la estructura tridimensional de la proteína.
Antes de que pudieran visualizar completamente el complejo Ku-ADN, Goldberg y sus colegas decidieron estudiar sólo al heterodímero Ku. Los intentos para preparar cristales de la proteína Ku sólo produjeron algunos cristales usables de los centenares que prepararon. Afortunadamente, los científicos fueron capaces de utilizar una técnica iniciada por el investigador del HHMI, Wayne Hendrickson, para resolver la estructura completa del heterodímero Ku a partir de un solo cristal. La técnica, llamada difracción anómala de longitud de onda múltiple, fue aplicada durante los análisis cristalográficos realizados en la Fuente Nacional de Luz Sincrotrón del Laboratorio Nacional de Brookhaven. Una vez determinada la estructura de Ku, los científicos continuaron resolviendo la estructura del complejo Ku-ADN.
En los estudios, Goldberg y sus colegas tuvieron que imitar la rotura del ADN, asegurándose de que el fragmento de ADN a ser ensayado tuviera sólo un extremo accesible —para evitar que Ku se uniera a más de un sitio en el ADN—. Esto se logró bloqueando el otro extremo del ADN con un voluminoso motivo de ADN.
Luego de resolver la estructura de Ku unido al ADN, Goldberg y sus colegas pudieron ver cómo el heterodímero Ku se las arregla para “encontrar” un extremo cortado de ADN, independientemente de su secuencia. El problema es que Ku no actúa como un factor transcripcional que se une a una secuencia específica de ADN”, dijo Goldberg. “En cambio, le interesa reconocer cualquier ADN cortado. Y la estructura nos mostró que Ku es una molécula de forma anular que puede deslizarse hacia el extremo apenas se produce una rotura.”
La estructura del complejo Ku-ADN revela que el heterodímero Ku forma un anillo que rodea y “alberga” al extremo de la hebra de ADN. “Creemos que las proteínas Ku tienen que mantener juntos los extremos de ADN”, dijo Goldberg. “El interrogante es cómo sostener el extremo de un pedazo de ADN sin ocultarlo. Encontramos que nuestra proteína tiene una extensa base que alberga al ADN, con un puente muy estrecho que yace sobre la superficie —sosteniendo un costado del ADN casi por completo, pero dejando el otro lado casi totalmente expuesto—. Pensamos que esta exposición podría permitir que otros factores de reparación actúen sobre los extremos cortados para repararlos.”
Los científicos especulan que las proteínas Ku en dos extremos cortados se ligan unas a otras para mantener a los dos extremos en la posición adecuada para ensamblar nuevamente el ADN. Goldberg y sus colegas también encontraron que el heterodímero Ku no toma ningún tipo de contacto con las bases de ADN, pero se toma de la columna de azúcar de la hebra de ADN —lo que significa que a la proteína no le “importa” la secuencia de ADN a la que se une—. Los científicos también tienen evidencia de que Ku mantiene al ADN en una alineación precisa para permitir la rápida unión por las enzimas de reparación. “Es lógico que la alineación precisa de los extremos de ADN, que realiza la proteína, de una ventaja a las proteínas de reparación y a las ligasas que son las que en definitiva unen los extremos de ADN”, dijo Goldberg.
En el futuro, Goldberg y sus colegas planean explorar la estructura de las proteínas Ku unidas a dos hebras rotas de ADN, para entender el mecanismo por el cual alinean a los extremos con precisión. Esta precisión es la clave de la exactitud del proceso de unión, que podría ayudar a la reparación, en ausencia de homología natural de las hebras separadas, dijo Goldberg.


La enzima, ADN ligasa, repara los millones de discontinuidades de ADN generadas durante la vida normal de la célula, por ejemplo, acoplando los abundantes fragmentos de ADN formados durante la copia del material genético en la división celular."Nuestro estudio muestra que la ADN ligasa cambia de una forma abierta, extendida, a una forma cerrada, circular, a medida que va uniendo las hebras del ADN", explica Tom Ellenberger, coautor del estudio, y director del Departamento de Bioquímica y Biofísica Molecular de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington en St. Louis.El ADN es sorprendentemente reactivo bajo la embestida continua de toxinas ambientales y metabolitos celulares. La reparación del ADN dañado es vital para mantener la integridad del diseño genético.
En esta ilustración, la ADN ligasa, en color, rodea la doble hélice del ADN. (Foto: WUSTL)
Cuando estos procesos de reparación se desequilibran, las células pueden funcionar mal, morir o volverse cancerosas, por lo que es muy importante saber cómo los "mecánicos del ADN" hacen su trabajo. Las ADN ligasas son blancos atractivos para la quimioterapia del cáncer y otras enfermedades.La enzima opera coordinadamente con otra proteína de forma anular, conocida como Sliding Clamp (abrazadera deslizante). Las proteínas de este grupo, como por ejemplo la PCNA humana, actúan como reguladores maestros de la reparación de ADN, guiando a las enzimas correctoras al sitio dañado."Creemos que cuando la ligasa se acopla a la PCNA y rodea al ADN, se eyectan otras proteínas reparadoras desde la PCNA", explica Ellenberger. En este caso, la ligasa sería el inspector de calidad que certifica que el ADN está listo para el paso final de unir los extremos.Para visualizar las complejas y dinámicas estructuras de la ADN ligasa y la PCNA, tanto individualmente como en asociación, Ellenberger y su grupo trabajaron en estrecha colaboración con científicos del Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley.Los investigadores usaron una combinación de cristalografía de rayos X y dispersión de rayos X de pequeño ángulo (SAXS), valiéndose de un organismo modelo llamado Sulfolobus solfataricus que comparte muchas características bioquímicas de organismos multicelulares, incluyendo a los humanos.Los resultados de esta investigación muestran por primera vez cómo se ensamblan dinámicamente estas proteínas y cambian su forma para unir los extremos del ADN durante la copia y reparación.


Revelado un mecanismo de reparación del ADN
El hallazgo ha sido realizado por investigadores del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa del CSIC de Madrid y de la Universidad de Sussex (Reino Unido)

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Un estudio dirigido por Luis Blanco, del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa del CSIC en Madrid, y Aidan Doherty, de la Universidad de Sussex en Brighton (Reino Unido) ha descifrado un mecanismo de reparación del ADN, un proceso esencial cuya alteración ha sido implicada en el desarrollo del cáncer, en la bacteria de la tuberculosis. Las conclusiones de la investigación se publican en "Science".

El trabajo, que analiza la maquinaria utilizada para reparar una peligrosa forma de daño en el ADN, arroja luz sobre cómo los finales de las dobles roturas de cadena en el ADN se vuelven a unir y reparar. Las dobles roturas de cadena, en las que ambas caras de la doble hélice del ADN se rompen, pueden convertir en inestable el genoma y hacerlo proclive a mutaciones que conducen al cáncer y a otras enfermedades.

La mayoría de dobles roturas de la cadena tienen finales dañados no complementarios que deben ser conectados y sintetizados de nuevo. Este mecanismo de reparación se denomina "reunión de extremos no homólogos" (NHEJ). Los científicos han analizado la estructura de la proteína compleja que realiza este proceso en el bacilo Mycobacterium tuberculosis, la bacteria responsable de la mayoría de los casos en humanos de tuberculosis en el mundo. Los resultados revelan la base estructural de cómo se produce esta reparación del ADN.

Estudios anteriores habían mostrado que este mecanismo de reparación está basado únicamente en dos proteínas: Ku y Ligasa D. Esta última es una proteína multifuncional (LigD) compuesta por tres dominios independientes que le aportan las actividades enzimáticas necesarias para restaurar la integridad genómica.

Según explica Luís Blanco, el trabajo muestra que el dominio polimerasa de la LigD es el responsable de mediar la sinapsis de los extremos en una rotura de cadena doble. Dos unidades de proteína participan en el proceso, encargándose cada una de interaccionar con uno de los extremos, orientándolos para su conexión.

"Hasta el momento existía muy poca información de cómo las diferentes actividades de procesamiento de extremos que operan durante el NHEJ, ya fuesen proteínas independientes (mamíferos) o dominios estructurales de una única proteína (bacterias), actuaban de forma secuencial y coordinada", añade Blanco.

Según el investigador, con el que también han trabajado los investigadores Raquel Juárez y Ángel J. Pitcher, estos estudios son extrapolables al sistema de NHEJ de mamíferos y suponen la identificación de una posible diana de interferencia del proceso de reparación de roturas de cadena doble en estas bacterias.

Se ha demostrado que este proceso de reparación es una fuente de variabilidad genética en bacterias, necesaria para que estos organismos puedan sobrevivir adaptándose a situaciones de estrés tóxico para el ADN. Para Blanco, la eliminación selectiva de este proceso podría tener importancia clínica como fórmula para minimizar el impacto de la adquisición de determinadas resistencias bacterianas.


Una vez que los radicales libres producen su efecto negativo también existen mecanismos celulares para reparar los daños. Los efectos sobre el ADN de nuestros genes pueden ser variados. Por ello existen diversos sistemas enzimáticos específicos de reparación para los mismos. Las consecuencias de la actuación de los radicales libres sobre las proteínas también son químicamente diversas conduciendo a su anormalidad. Nuestras células disponen de sistemas enzimáticos especiales para reconocer a las proteínas anormales y proceder a su destrucción intracelular. En cuanto a los lípidos y su peroxidación ("enranciamiento") ocasionada por los radicales libres, también se han descubierto enzimas especiales glutatión peroxidasas capaces de eliminar a los ácidos grasos peroxidados.
Según un estudio que se publica hoy en Science y en el que ha participado Timothy Thomson, del Instituto de Biología Molecular del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, en Barcelona, la proteína RNF8 participa en la reparación del ADN, lo que puede tener una implicación futura en procesos oncológicos.
El hallazgo profundiza en el conocimiento de los complejos sistemas bioquímicos que utiliza el organismo para asegurar la integridad del genoma, evitando que los daños en las cadenas de ADN lleguen a provocar la muerte de las células o su mutación en células cancerosas.
El trabajo se ha llevado a cabo en modelos celulares en los que se ha demostrado que RNF8 es imprescindible para que en los sitios de daño al ADN acudan proteínas con capacidad reparadora. Funciona, por tanto, como parte de un sistema de alarma ante daños en el genoma pero, por el momento, no se sabe qué importancia tiene en el desarrollo de tumores.